Estudios fisiológicos y genéticos de la interacción ABA / SA en respuesta a estrés hídrico en Panicum virgatum L

Abstract

Panicum virgatum (pasto varilla, switchgrass) es una especie perenne de clima subtropical, originaria de las praderas de Estados Unidos que fue introducida en la Región Pampeana Semiárida por investigadores de la UNLPam y del INTA y se encuentra actualmente bajo estudio. El valor agronómico de P. virgatum tiene su fundamento en el alto nivel de productividad en parcelas de experimentación comparada con otras especies evaluadas localmente que, asociado a la naturaleza perenne del cultivo, reduce la intensidad de manejo. El denso canopeo y extenso sistema radical -de alta eficiencia en la utilización de nutrientes y agua del suelo- la convierte en una especie adaptada a climas semiáridos. Estas características posicionan a P. virgatum como cultivo de bajo impacto ambiental en zonas marginales incapaces de soportar el laboreo anual. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio han profundizado en la respuesta a estrés hídrico a nivel hormonal y genético en P. virgatum, e indican que las hormonas de estrés Acido Abscisico -ABA- y Acido Salicilico -SA-, están participando y sugieren que el rol de ambas hormonas podría ser antagónico. Este trabajo profundiza en el estudio de la interacción ABA/SA mediante el análisis de la transcripción de genes de respuesta estrés cuya expresión es dependiente de ABA y SA, y actúan como indicadores de activación de la respuesta desencadenada por estas hormonas. Plantas jóvenes (55 días desde la siembra) de ambos cultivares se sometieron a estrés hídrico (60 % de Contenido Relativo de Agua -CRA) y rehidratación. Se realizó un pre tratamiento con ABA exógeno 100 µM mediante riego previo al inicio del tratamiento de estrés. El ensayo se realizó en macetas con sustrato suelo (1/3 suelo, 2/3 arena) y se condujo en cámara de crecimiento programada con 16 h de luz (300 µE. m2.s-1) a 29 °C, y 8 hs de oscuridad a 20 °C. En plantas de 55 días (estado V5) se proporcionó estrés hídrico mediante suspensión del riego. Se evaluó la recuperación de las plantas a las 24 hs posteriores a la rehidratación, para ello las macetas se regaron a capacidad de campo con agua destilada. El material vegetal se colecto en nitrógeno líquido, se procedió a la extracción con ARN total y se sintetizo ADN complementario (ADNc) de las muestras. Sobre este material se analizó la expresión de genes de respuesta a estrés hídrico (DREB2a), dependientes de ABA (RAB 18, RD22), y dependientes de SA (PR-2 y PR-5). Los productos de amplificación se sometieron a electroforesis horizontal en gel de agarosa (1%) y las imágenes se analizaron con el software J Image. Los resultados se analizaron mediante ANOVA y test LSD (n=3). RAB18 se comportó como un buen indicador de estrés hídrico dependiente de ABA, lo que valida su rol de gen reportero de estrés en Panicum virgatum en las condiciones del ensayo. Por el contrario, RD22 no mostró correspondencia con las situaciones de estrés hídrico, y demostró no ser apropiado como indicador de estrés hídrico, a pesar de ser ampliamente usado en otras especies. Por su parte, DREB2a no manifestó un comportamiento consistente, por lo cual requiere de un análisis más profundo en futuros ensayos. En cuanto a PR-2 (dependiente de SA), su expresión incrementó significativamente frente a estrés en plantas del cv. Kanlow, pero no en aquellas del cv. Greenville. Sin embargo, el pre-tratamiento con ABA exógeno en el cv. Kanlow inhibió su expresión bajo estrés hídrico. El gen PR5, por su parte, incrementó su expresión en ambos cultivares durante el estrés, sin embargo cuando las plantas fueron pre-tratadas con ABA exógeno, no se detectó la presencia de transcriptos. Así, PR2 y PR5 en conjunto reprimen su expresión en plantas pre tratadas con ABA, sugiriendo que la vía de respuesta activada por SA, reportada por la expresión de los genes PR, estaría silenciada ante la presencia de altos niveles de ABA. Estos resultados son novedosos en cuanto no se ha investigado a la fecha la participación de SA en respuestas a estrés hídrico en Panicum virgatum. Finalmente, el presente trabajo aporta nuevos conocimientos sobre la tolerancia a estrés en P. virgatum, cultivo energético con importantes perspectivas para regiones semiáridas.

P. virgatum (switchgrass) is a perennial grass native to the US prairies that was introduced in the Semi-arid Pampean Region by researchers from UNLPam, and INTA and is currently under study. The agronomic value of P. virgatum is based on the high level of productivity in experimental plots compared to other locally evaluated species, which, combined with the perennial nature of the crop, reduces the intensity of management. The dense canopy and extensive radical system - high efficiency in the use of nutrients and soil water - makes it a species adapted to semi-arid climates. These features locate P. virgatum as a low environmental impact crop in marginal areas that are unable to withstand annual tillage. Previous studies conducted in our laboratory have deepened the response to water stress at the hormonal and genetic levels in Panicum virgatum, and indicate that the stress hormones Abscisic Acid (ABA) and Salicylic Acid (SA) participate in water stress response and suggest that the role of both hormones could be antagonistic. This current work investigates the study of the ABA / SA interaction by analyzing the transcription of stress response genes, whose expression is dependent on ABA and SA and act as hormonedependent reporters. Young plants (55 days from sowing) of both cultivars were subjected to water stress (60% Relative Water Content -CRA) and rehydration. A pre-treatment with 100 µM exogenous ABA was performed by irrigation prior to the start of the stress treatment. The assay was performed in pots with soil substrate (1/3 soil, 2/3 sand) and was conducted in a growth chamber programmed with 16 h of light (300 µE.m2.s-1) at 29 ° C, and 8 Hrs of darkness at 20 ° C. Water stress was provided by suspending irrigation. Once stress was reached, pots were re watered at field capacity and plant recovery was evaluated 24 h after rehydration. The plant material was collected in liquid nitrogen, total RNA extraction was performed and complementary DNA (cDNA) from the samples was synthesized. Expression of water stress response genes (DREB2a), ABA-dependent (RAB 18, RD22), and SA-dependent (PR-2 and PR-5) were analyzed on this material. The amplification products were subjected to agarose gel electrophoresis (1%) and the images analyzed with the J Image software. The results were analyzed using ANOVA and LSD test (n = 3). RAB18, was as a good indicator of ABA-dependent water stress, which validates its role as a stress reporters in Panicum virgatum under evaluated conditions. On the other hand, expression of RD22 did not correlate with water stress situations, suggesting that it is not a proper reporter, even though these genes are widely used in other species. Results of DREB2a gene expression were not conclusive and require deeper future studies. Regarding SA-dependent PR-2, its expression increased significantly against stress in cv. Kanlow, but not in cv. Greenville. However, pre-treatment with exogenous ABA in cv. Kanlow inhibited its expression under water stress. PR5, on the other hand, increased its expression in both cultivars during stress, however when plants were pretreated with exogenous ABA, the presence of transcripts was not detected, suggesting that the SA-activated response pathway would be silenced when ABA is present. These are original results due to SA has not been reported before in an abiotic response to water stress in Panicum virgatum. Finally, the present work provides new knowledge on stress tolerance in P. virgatum, an energy crop with important prospects for semiarid regions.