Glicosil hidrolasas involucradas en biotransformaciones industriales

Abstract

El proyecto está dirigido a la caracterización de sistemas enzimáticos provenientes de microorganismos extremófilos aislados en nuestro laboratorio. Las actividades enzimáticas a estudiar son enzimas con potencial uso industrial, que portan caracteres propios de los ambientes extremos de donde los microorganismos fueron aislados. En una primera etapa del proyecto (proyecto de investigación del departamento de Química n°65, Resolución 81/05) Se utilizaron muestras de la Patagonia y Antártida argentinas como fuente de catalizadores frío-activos. Se aislaron y seleccionaron numerosos microorganismos, que luego se identificaron a través de técnicas bioquímicas y moleculares. Se eligieron biocatalizadores de acuerdo a sus propiedades catalíticas en diferentes condiciones, y se encuentra en marcha su purificación y caracterización. En esta segunda etapa se pretende continuar con la identificación de cepas, producción de las proteínas a escala de laboratorio, inmovilización y sistemas de purificación escalable (downstream processing) de los catalizadores. También se estudiará su estabilidad mediante el uso de diferentes aditivos protectores con vistas a la formulación de una preparación enzimática y estudios básicos. Haremos hincapié en el ensayo de los sistemas enzimáticos con sus respectivos sustratos naturales para poder correlacionar las actividades sobre sustratos artificiales y los complejos sistemas donde estos deberán ser aplicados.

The technological applications of glycosyl hydrolases (ec 3.2.1) range from paper industry, food and biofuel production to fine chemicals industry. Recently, Biocatálisis-UNLPam Group described a novel enzymatic activity: a- rhamnosyl-B-glucosidase (ec 3.2.1.168) produced by the fungal strain acremonium sp. DSM24697. This is an ectoenzyme that is released in soluble form into the extracellular medium during conidiogenesis. Because of the substrate specificity of this enzyme for 7-o-rutinosilated flavonoides, together with its mode of action that allows one-step deglycosilation, it presents promising characteristics for industrial applications. In this work inexpensive by products of the citrus industry (orange and lemon'pellets' used as cattle feed) were used to optimize the production of a-rhamnosyl-B-glucosidase activity. The obtained enzyme preparation was compared to commercial glycosidases. The a- rhamnosyl-B-glucosidase activity was detected in the culture supernatant of acremonium sp. DSM24697 5-7 days cultivation. The maximum production was observed with hesperidin-pellets culture medium in 1:4 ratio (15,9 and 8,5 u/l for orange and lemon pellets, respectively). Zymographic analysis of the culture supernatant showed a single band with the substrates 4-methylumbelliferyl-rutinoside and hesperidin, corresponding to the a-ramnosil-B-glucosidase. Furthermore, the commercial enzyme cocktails hydrolyzed xylan, carboxymethylcellulose and the tested fluorogenic substrates tested, although were unable to hydrolyze hesperidin.